Buon giorno a tutti, la ricerca scientifica va avanti

Nel 1965, il famoso regista indiano Satyajit Ray creò un amato detective immaginario di nome Feluda. In una serie di racconti, l'astuto gumshoe rintraccia un vandalo che cerca di distruggere gli antichi templi dell'India, fa scoppiare un racket di medicinali contraffatti a Kathmandu e pulisce gli orologi dei contrabbandieri di Bombay. Ispirati dalle grandi capacità analitiche del detective, i ricercatori del Council of Scientific and Industrial Research (CSIR) di Delhi-Institute of Genomics and Integrative Biology hanno dato alla loro nuova diagnostica CRISPR per COVID-19 l'affettuoso soprannome di Feluda (abbreviazione di FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay). TataMD Check, il nome commerciale del test alimentato da Feluda, è stato lanciato il 9 novembre in India.

Il test utilizza il sistema CRISPR-Cas per sondare le sequenze genetiche specifiche del virus SARS-CoV-2 in campioni di tamponi nasali o saliva applicati a una striscia di carta. Come l'immaginario Feluda, è veloce, preciso e funziona in tutti i tipi di impostazioni sul campo, secondo un preprint pubblicato su medRxiv a settembre. Le agenzie di regolamentazione in India hanno condotto una valutazione indipendente del test su campioni di pazienti e hanno riscontrato che Feluda è estremamente accurato nel rilevare le infezioni da COVID-19.

"La combinazione di precisione, velocità e convenienza in questa tecnologia è notevole", afferma Prashant Yadav, esperto di filiera sanitaria e senior fellow presso il Center for Global Development di Washington, DC, un think tank ampiamente supportato dal Bill & Fondazione Melinda Gates.

Il 19 settembre il Drugs Controller General of India ha approvato Feluda per uso commerciale e, in un avviso del 22 ottobre, l'Indian Council of Medical Research ne ha approvato l'uso da parte di laboratori pubblici e privati. Il test costa circa 500 rupie (6,75 dollari USA) per essere prodotto ed elaborato in laboratorio per un campione di un paziente e fornisce i risultati entro un'ora.

"Una volta convalidato su larga scala e risolti i problemi di produzione commerciale, può diventare il pilastro dei test COVID-19, non solo in India ma in molti altri paesi del mondo che sono alla ricerca di un test veloce, conveniente e preciso", afferma Yadav, che non è coinvolto nel progetto.

Il primo caso di COVID-19 segnalato in India è stato il 30 gennaio e la prima morte il 12 marzo. All'inizio della pandemia, i test erano limitati a pochi laboratori finanziati con fondi pubblici in India. Successivamente, è stato esteso ai laboratori privati. Tuttavia, la capacità è limitata. L'India attualmente testa solo circa lo 0,1% della sua popolazione di 1,4 miliardi ogni giorno, facendo sì che il paese si collochi tra i più bassi al mondo su base pro capite.

Gli Stati Uniti hanno quasi lo stesso numero di test al giorno - circa 1,2 milioni, rispetto a 1,5 milioni dell'India - ma una popolazione che è più piccola di un fattore quattro, spiega Gautam Menon, professore di fisica e biologia presso l'Università di Ashoka e presso l'Istituto di Scienze matematiche in India che non erano coinvolte nella ricerca. "Penserei che dovremmo testare circa lo 0,5 per cento della nostra popolazione ogni giorno, come ideale, ma stiamo testando più che mai", dice.

All'inizio di quest'anno, un team di ricercatori della società biotecnologica MyLab Discovery Solutions con sede a Pune ha sviluppato un kit di test, PathoDetect, per COVID-19 che restituisce risultati in 2,5 ore con una precisione del 100%. È stato il primo test PCR in tempo reale per il nuovo coronavirus prodotto in India che è stato approvato nel paese. Costa circa $ 16. Per PathoDetect, un fattore limitante significativo è il costo della macchina per PCR in tempo reale stessa, che può essere di circa $ 26.000 USA.

Feluda, tuttavia, utilizza una striscia di carta per rivelare i risultati, simili alla lettura di un test di gravidanza. Chiunque possa eseguire una normale macchina PCR e seguire un semplice protocollo di pipettaggio può farlo, afferma lo scienziato co-responsabile Debojyoti Chakraborty. Feluda può essere eseguito in qualsiasi laboratorio diagnostico o centro sanitario che ospita una semplice macchina per PCR e le sue apparecchiature e i reagenti sono meno costosi di quelli di PathoDetect.

Il test è stato testato su più di 2.000 campioni. Ha rilevato coloro che hanno SARS-CoV-2, una misura della sensibilità, il 96% delle volte, escludendo coloro che non avevano il virus, una misura della sua specificità, il 98% delle volte.

Dall'anemia falciforme a COVID-19

Feluda è emerso dalla "serendipità", dice Chakraborty. Negli ultimi due anni e mezzo, lui e il suo collega Souvik Maiti hanno lavorato a un sistema Cas9 in grado di rilevare la mutazione nel gene che causa l'anemia falciforme per la diagnostica CRISPR point-of-care. Per testare il loro approccio, si sono recati in remoti centri sanitari nello stato di Chattisgarh in India e hanno raccolto campioni di saliva da persone note per avere l'anemia falciforme e da potenziali portatori silenziosi della mutazione.

Mentre stavano preparando la pubblicazione dei loro risultati a gennaio, COVID-19 ha colpito e si sono chiesti se potevano riutilizzare la tecnologia per rilevare SARS-CoV-2.

Iniziando subito, dice Chakraborty, il suo team di dottorandi e postdoc ha lavorato giorno e notte, con alcuni colleghi che si sono ammalati del virus lungo la strada. A marzo avevano sviluppato un prototipo diagnostico e in maggio hanno concesso in licenza la tecnologia a TATA Medical and Diagnostics Limited, che l'ha introdotta attraverso l'approvazione normativa.

Feluda funziona convertendo prima l'RNA virale da un campione in DNA e poi amplificando specifici geni virali tramite PCR, durante la quale inserisce un tag di biotina sui prodotti amplificati. Successivamente, il campione viene incubato nella stessa provetta per PCR con un complesso di RNA guida FnCas9 marcato in modo fluorescente, che cerca queste sequenze da SARS-CoV-2 e si aggancia su di esse, creando un complesso più grande di FnCas9 fluorescente e marcato con biotina sequenza di DNA virale. Quindi, il tecnico aggiunge un tampone e immerge una striscia di carta nel tubo. Le nanoparticelle d'oro sulla carta riconoscono l'etichetta fluorescente e l'intero complesso scorre lungo la striscia e viene depositato su una linea di streptavidina, che interagisce con l'etichetta della biotina sul DNA. L'accumulo delle nanoparticelle produce il segnale visibile.

Ci sono una manciata di altri test basati su CRISPR per COVID-19, incluso uno sviluppato dal MIT e dall'Università di Harvard, e questi impiegano proteine Cas12 o Cas13 per trovare il virus.

Harikrishnan Jayamohan, uno scienziato ricercatore presso l'Università dello Utah che non è stato coinvolto nel lavoro, dice: "Se Feluda lavora su larga scala in India, questa sarebbe una buona alternativa alla RT-PCR. Questo sarebbe anche un grande passo avanti rispetto ai test antigeni, che sono ampiamente usati, economici, veloci e facili da usare ma hanno una sensibilità molto bassa ". Quasi il 50% della diagnostica COVID-19 in India viene eseguita tramite test antigene.

"Feluda è bravo in un certo senso", afferma Rakesh Kumar Mishra, il direttore del CSIR-Center for Cellular and Molecular Biology di Hyderabad, che non è stato coinvolto nella ricerca Feluda. Sarà particolarmente utile in luoghi remoti perché Feluda può lavorare con una semplice macchina PCR e quella macchina può essere alloggiata in un centro sanitario rurale. Ma il vero valore di un test su strisce di carta è quando può essere utilizzato per l'auto-test oa casa, dice Yadav, anche se Feluda non è ancora pronto per questo.

"Questa è una cosa difficile che stiamo combattendo", dice Mishra. "Qualsiasi strumento è un buon strument".